Naučnici hakuju genetski kod da bi proteinima dali nove moći

„To je krajnje uzbudljiva oblast“, kaže Džejson Čin, biolog iz Laboratorije MRC za molekularnu biologiju u Kembridžu

Tokom najvećeg dela istorije života na Zemlji, genetske informacije se prenose u kodu koji specifikuje samo 20 aminokiselina. Aminokiseline su gradivni blokovi proteina, koji obavljaju najveći deo teškog rada u ćeliji; njihovi bočni lanci upravljaju proteinskim savijanjem, inerakcijama i hemijskih aktivnostima. Ograničavajući raspoložive bočne lance, priroda ograničava vrste reakcija koje proteini mogu da izvedu.

Na doktorskim srudijama tokom 1980-ih, Piter Šulc se čudio zašto priroda ograničava sebe na taj način – i počeo da pokušava da zaobiđe to ograničenje. Nekoliko godina kasnije, kao profesor na Kalifornijskom univerzitetu u Berkliju, Šulc i njegov tim uspeli su da to urade prepravljajući mehanizam proteinske sinteze. Iako ograničen na epruvetu, taj rad je predstavljao ključni rani uspeh u pokušajima da se hakuje genetski kod, piše Nature.

Preporučujemo

Otada su mnogi istraživači išli Šulcovim putem, podešavajući ćelijski aparat za izgradnju proteina kako bi se izmenili postojeći makromolekuli i kako bi se stvorili polimeri od potpuno novih gradivnih blokova. Dobijeni molekuli se mogu koristiti u istraživanju i za razvoj terapeutike i materijala. Međutim, to je težak posao pošto je proteinska sinteza najvažnija ćelijska funkcija koja se ne može lako izmeniti.

„To je krajnje uzbudljiva oblast“, kaže Džejson Čin, biolog iz Laboratorije MRC za molekularnu biologiju u Kembridžu u Ujedinjenom Kraljevstvu. „Čak od početka, mislim da je bilo jasno da radimo nešto zaista posebno“.

Od vitro do vivo

Da bi se razumelo zašto, moramo pogledati kako se proteini stvaraju.

Tokom transkripcije, čitanja genetskih informacija, instrukcije iz DNK se kopiraju u RNK, što se zatim prevodi u proteine u molekularnoj mašini zvanoj ribozom. Svaki bazni triplet u RNK poruci (adenin, citozin guanin i uracil) predstavlja reč ili kodon ili genetski kod. Postoje ukupno 64 reči – 61 obavlja kodiranje za aminokiseline i tri signaliziraju ribozomu da stane.

Aminokiseline su dovedene do ribozoma transportnim RNK (tRNK), od kojih svaka korespondira sa komplementarnim kodonom. Enzimi poznati kao aminoacil-tRNK sintetaze spajaju tRNK sa pripadajućom aminokiselinom.

Da bi ovaj sistem prihvatio neprirodno ili „nekanonsko“, aminokiseline u epruveti su zahtevale nekoliko ključnih izmena. Prvo, Šulcov tim je smislio način da hemijski prikači neprirodne aminokiseline za tRNK koje mogu prepoznati jedan od tri kodona koji signaliziraju zaustavljanje. Zatim su uneli kodon koji signalizira zaustavljanje u gen za protein otporan na penicilin, beta laktamazu. Upotrebom ovih modifikacija, istraživači su proučavali kako raličite nekanonske varijante proteina utiču na aktivnost enzima.

Međutim, to je bilo u epruveti. Da bi se nekanonske aminokiseline inkorporirale u žive ćelije, tim je morao da dopuni prevodilački aparat ne manjajući ga. To su uradili identifikujući i modifikujući tRNK i aminoacil-tRNK sintetaze koje su bio-ortogonalne prema ćeliji domaćinu – tj. nesposobne da prepoznaju (i budu prepoznate) druge delove prevodilačkog mahanizma ćelije.

„Ljudi su mislili da će to biti veoma, veoma teško“, kaže Šulc, sada predsednik i izvršni direktor Instituta Skrips u La Hoji, Kalifornija. „Srećom smo bili dovoljno naivni da mislimo da ćemo uspeti“. (Šulc je osnovao nekoliko kompanija, uključujući „Ambrks“ , koja razvija bioterapeutiku koristeći nekanonske aminokiseline. Trenutno je član naučnog savetodavnog odbora te kompanije.)

Naposletku, Šulcov tim se odlučio za bazni par tRNK-sintetaze iz arheona, Methanococcus jannaschii, koji nije odmah prepoznavao tRNK ili sintetaze iz bakterije Escherichia coli, koju su planirali da modifikuju. Tim je optimizovao molekule da budu selektivni u odnosu na novu aminokiselinu. Godine 2001, istraživači su ugradili svoj sistem u bakteriju, omogućujući ćelijama da inkorporiraju nestandardne aminokiseline u proteine koristeći sopstveni prevodilački mehanizam.

„To je verovatno bio početak ekspanzije genetskog koda in vivo, kaže Čin, koji je nekada bio na postdoktorskim studijama u Šulcovoj laboratoriji.

Sve veći komplet alata

Šulcov tim i drugi su koristili ovaj pristup da genetski kodiraju više od 200 nestandarnih aminokiselina u proteine, obezbeđujući moćan instrument za izučavanje proteinske strukture i funkcije. Naučnici mogu, na primer, uvesti fluorescentne markere ili druge oznake u proteine, ili izvoditi eksperimente u kojima su proteini deaktivirani („zatvoreni u kavez“) hemijskim grupama koje mogu biti uklonjene pomoću svetlosti.

Naučnicu su takođe otišli dalje od bakterije E. coli da hakuju genetski kod valjkastih crva, vinskih mušica, biljaka i čak miševa. Čin i Majkl Hejstings, neuronačnik sa Univerziteta Kembridž, i njihove kolege, na primer, hakovali su tRNK i tRNK sintetazu za aminokiselinu pirolizin kako bi inkorporirali aminokiselinu zvanu alkinlizin u proteine. Iskoristili su je da uključe ili isključe gene u moždanim ćelijama miša. Istraživači su uklonili ključni protein uključen u regulisanje cirkadijalnih ritmova – dnevnih ciklusa pod kontrolom unutrašnjeg telesnog sata – i uveli novu verziju gena u ćelije koji može biti preveden samo u prisusutvu alkinlizina. Pošto miševi nisu mogli sami da naprave tu aminokiselinu, istraživači su mogli da kontrolišu njihove cirkadijalne ritmove dodajući ili oduzimajući aminokiseline vodi koju ti glodari piju.

Što se tiče Šulca, on koristi prošireni genetski kod da ispita kako bi organizmi izgledali kad bi imali više od 20 aminokiselina na raspolaganju. U jednoj studiji, njegov tim je napravio biblioteku varijanata homoserina O-sukciniltransferaze u E. coli, enzima uključenog u biosintezu aminokiseline metionina, naročito osetljivog na temperaturu, u kom je svaki kodon izvan katalitičkog centra enzima zamenjen nekanonskom aminokiselinom alaninom. Tim je otkrio varijantu koja je stabilna na temperaturi do 21 stepen Celzijusa iznad tipičnog opsega – taj poduhvat su pripisali formiranju hemijske veze između alanina i još jedne aminokiseline.

Čin, Šulc i drugi istraživači su takođe počeli da primenjuju ovu tehnologiju u razvoju terapeutike. Lei Vang, biolog sa Kalifornijskog univerziteta u San Francisku, na primer, razvija proteinski bazirane lekove koji mogu da formiraju kovalentne veze sa drugim biomolekulima.

Proteini obično imaju interakciju sa drugim molekulima putem relativno slabih, nekovalentnih interakcija, ali kovalentno vezivanje bi moglo da poveća njihovu snagu, kaže Vang. Godine 2020, njegov tim je inkorporirao nekanonsku aminokiselinu fluorosulfat-L-tirozin u PD-1, regulator imunskog sistema, kako bi stvorio antitumorski lek. Obično interakcija između PD-1 na T ćelijama i PD-L1 na tumorskim ćelijama smanjuje imunski odgovor, omogućavajući tumoru da izbegne imunsku kontrolu. Kad je Vangov tim ubrizgao fluorosulfat-L-tirozin koji sadrži PD-1 u miševe sa ubačenim ljudskim ćelijama raka, protein je formirao ireverzibilnu kovalentnu vezu sa PD-L1, što je dovelo do smanjivanja tumora. Vang je naučni savetnik u kompaniji „Enlaza terapeutiks“ u La Hoji, koja je razvila ovu terapeutsku strategiju.

Istovremeno, u Pekingu, Tao Liu, biolog sa Pekinškog univerziteta, i njegov tim primenjuju genetsku ekspanziju na ćelijsku i gensku terapiju. U studiji iz 2021, Liu i njegov tim izvestili su o stvaranju ćelija koje, u prisusutvu sintetičke aminokiseline O-metil-tirozin, ekstrahuju insulin. Nakon što se unese u dijabetične miševe, istraživači mogu da kontrolišu nivoe glukoze u krvi tih životinja kontrolišući koliko O-metil tirozina ubacuju u njihovu hranu.

Sve šira primena

Osim kodiranja novih aminokiselina, jedna primena proširenog genetskog koda je genetska izolacija. Sa 61 kodonom za 20 aminokiselina, genetski kod je suvišan, što znači da brojni kodoni kodiraju istu aminokiselinu. To je takođe gotovo univerzalno. Zamenjujući sve instance datog kodona sinonimnim i uklanjajući mehanizam koji koristi originalni kodon, istraživači mogu da učine ćeliju u suštini imunom na stranu DNK – uključujući patogene.

U studiji iz 2022, Čin i njegov tim su demonstrirali taj koncept; stvorili su E. coli mutanta u kom su dva od njegovih šest serinskih kodona prenamenjena da kodiraju za druge aminokiseline – zatim su uklonili tRNK koje su prepoznavale originalne serinske kodone. Dalje su modifikovali sistem kako bi osigurali da virusi ne mogu upotrebiti sopstvene tRNK, ako su ih imali. Dobijene ćelije su bile otporne na horizontalni genski transfer iz drugih bakterija, kao i na virusnu infekciju. U dokumentu objavljenom ranije ove godine, još jedan tim, predvođen biologom Džordžom Čerčom na Univerzitetu Harvard u Kembridžu u Masačusetsu, primenio je sličan metod „genetskog zida“ da stvori bakterije otporne na fag.

Istraživači takođe mogu koristiti modifikovani genetski kod da stvore polimere. Činov tim je 2021. godine hakovao genetski kod u cilju sintetizovanja kratkih polimera, pa čak i veštačke cirkularne strukture zvane mikrocikl, u E. coli. Čin se sad nada da će unaprediti ovu tehnologiju radi stvaranja ćelijskih fabrika koje mogu da prizvode velike količine potpuno novih polimera, kao što su plastični materijali. Poput proteina, plastični materijali su sastavljeni od dugačkih nizova monomera. Međutim, iako genetski kod diktira redosled aminokiselina u proteinima, nijedan ekvivalentan sistem ne postoji za veštačke polimere.

„Ako bismo mogli da kodiramo proširen skup gradivnih blokova na isti način na koji možemo proteine, mogli bismo da pretvorimo ćelije u žive fabrike za kodiranu sintezu polimera za sve od novih lekova do materijala“, kaže Čin, koji je osnovao kompaniju „Konstruktiv bio“, baziranu u Safron Voldenu u Ujedinjenom Kraljevstvu.

Pomeranje granica

Pored prenamene kodona, istraživači mogu takođe povećati broj raspoloživih proteinskih gradivnih blokova proširujući alfabet nukleinskih kiselina sa četiri na šest baza, povećavaju tako broj mogućih triplet kodona na 216. Godine 2014, tim predvođen biohemičarem Flojdom Romsbergom, koji je tada bio u Institutu Skrips, izvestio je o stvaranju soja bakterije sa šestobaznim genetskim alfabetom koji se može uspešno replikovati. Taj tim je kasnije demonstrirao da te ćelije mogu koristiti svoj prošireni DNK da proizvedu proteine koji sadrže nekanonske aminokiseline.

Drugi pristup je da se poveća dužina kodona sa tri na četiri baze, povećavajući tako broj mogućih kodona na 256. Ovo zahteva modifikaciju brojnih delova prevodilačkog mehanizma, uključujući ribozom. Čin i njegov tim su upotrebili ovu strategiju da inkorporiraju četiri nekanonske aminokiseline u E. coli na transkriptu koji takođe sadrži konvencionalne trobazne kodone. Drugi istraživači ispituju da li bi čak bilo moguće da se stvori četvorobazni genetski kod.

Neki istraživači pokušavaju ekstremnije modifikacije, uključujući modifikacije glavnog lanca – stvaranje takozvanih beta ili gama aminokiselina (naspram alfa aminokiselina, koje se nalaze u prirodi), ili aminokiselina koje su obrnuti odraz u ogledalu standardnih aminokiselina. Polimeri izgrađeni od bilo kojeg tipa tih gradivnih blokova verovatno bi bili veoma stabilni, pošto tipičan mehanizam za razlaganje proteina ne bi mogao da ih prepozna.

Međutim, postojeći prevodilački mehanizam nije stvoren da prihvati ove egzotične aminokiseline, uključujući aminoacil-tRNK sintetaze koje vezuju aminokiseline za tRNK. Hiroaki Suga, biolog na Tokijskom univerzitetu, razvio je 2006. godine zaobilazni put sa „fleksizimom“ , katalizatorom baziranim na RNK koji može obaviti posao proteinske sintetaze: povezivanje aminokiselina sa tRNK.

Suga se fokusira na sintetizovanje polimera in vitro, jer to obezbeđuje najveću flkesibilnost u smislu modifikacija koje on može da izvede. Koristeći fleksizim, njegov tim je iskombinovao do 11 nekanonskih aminokiselina sa 12 standardnih aminokiselina u jednom makrociklu. Suga je jedan od osnivača biotehnološke kompanije „Peptidrim“ u Kavasakiju, s ciljem razvijanja lekova pomoću iste tehnologije.

Opet, taj rad je in vitro; primena aminokiselina sa modifikacijom njihovog glavnog lanca ili konfiguracije na proteine u ćelijama ostaje izazov. Iako postoji nekoliko primera da su naučnici uspeli da inkorporiraju te egzotičnije aminokiseline, nužni su dalji koraci da bi proces bio efikasniji. Poput pronalaženja sintetaza koje bi mogle da rade sa ovim aminokiselinama in vivo, u mnogim slučajevima bi naučnici morali da dizajniraju ribozom koji može da procesuira nove aminokiseline – istovremeno obavljajući uobičajene zadatke.

U dve nedavne studije, Alana Šeparc, biolog na Kalifornijskom univerzitetu u Berkliju, i njen tim izveštavaju o koracima u pravcu rešenja tih problema. U jednom od dokumenata opisuju sintetazu iz arheona Methanomethylophilus alvus koja može da prihvati nealfa aminokiseline i bioortogonalna je prema E. coli.U drugom, tim izveštava o kompjuterskoj tehnici za skrining jedinstvenih monomera glavnog lanca koje ribozom E. coli može procesuirati efikasno. Istraživači kažu da će to pomoći identifikaciji nealfa aminokiselina kod kojih postoji najveća verovatnoća da su kompatibilne sa postojećim ribozomom.

Druge grupe rade na razvoju ribozoma koji može da proizvede proteine sa egzotičnim aminokiselinama „od nule“. Prošlog oktobra, istraživači na Univerzitetu Vestlejk u Hangdžou u Kini izvestili su o RNK polimerazi koja je kao odraz u ogledalu i koja može da sintetiše sve RNK molekule potrebne za proizvodnju ribozoma po modelu odraza u ogledalu. Iako je potrebno još mnogo koraka da bi takav ribozom postao realnost, stvaranje takvog molekula bilo bi važan korak u cilju korišćenja prevodilačkog mehanizma za pravljenje proteina po modelu odraza u ogledalu.

Drugi istraživači rade na reprogramiranju ribozoma radi stvaranja polimera sa ugljenik-ugljenik vezama, nasuprot azot-ugljenik amid vezama koje obično prave radi povezivanja aminokiselina.

Ako ove strategije urode plodom, to bi naučnicima dalo ogromnu sintetičku moć nad novim polimerima. Niko ne zna koja svojstva mogu proizaći iz sintetičkog polimera koji je napravljen sa istom dužinom i nivoom sekvencione definicije kao protein, „pošto nijedan takav molekul nije nikad napravljen“, kaže Šeparc. Međutim, ona i drugi se nadaju da će to uskoro postići. „Vrlo je uzbudljivo vreme za ovu oblast“.

(Telegraf Nauka/Nature)